Linha de Pesquisa: Doenças infecciosas comunitárias e nosocomiais
A urbanização altera o perfil das doenças infecciosas. Estudamos a prevalência, transmissão e virulência de patógenos de crescente importância no ambiente urbano, como agentes enteropatogênicos, patógenos respiratórios e fungos oportunistas.
Projeto
Características biológicas, epidemiológicas e patológicas da infecção esquistossomótica natural e experimental de roedores silvestres
Prof. José Roberto Machado e SilvaO homem é o hospedeiro mais importante na esquistossomíase. Em determinadas áreas de transmissão, os roedores silvestres (Nectomys squamipes e Akodon cursor) estão infectados porém, a prevalência da infecção natural é imprecisa. Nos roedores, a infecção é mais branda do que na espécie humana. Objetivos: Aprimorar os métodos de imuno-sorológicos de diagnóstico laboratorial que são limitados pela pouca sensibilidade; Avaliar a suscetibilidade do Nectomys squamipes a diferentes cepas do parasito e demonstrar a sua utilidade como modelos experimentais alternativos na esquistossomíase; Estudar a dinâmica de crescimento dos vermes em diferentes intervalos de tempo, através da análise biométrica e morfológica; Avaliar se passagens sucessivas de uma cepa em N. squamipes produzem alterações fenotípicas e genotípicas nos vermes adultos. A metodologia a ser empregada será a captura de animais em área de transmissão (Sumidouro, RJ) e realizar exame de fezes, necrópsia e as técnicas de ELISA e imunoblotting. Espécimes criados em laboratório são infectados, necropsiados com a retirada de órgãos para análise histopatológica e coleta de vermes adultos. Nestes são empregadas a análise morfométrica, microscopia eletrônica de varredura e a microscopia de varredura laser confocal. Estas técnicas são utilizadas e a análise genômica dos vermes para avaliar o efeito das passagens sucessivas no roedor. Espera-se que as técnicas de imunoblotting e ELISA sejam padronizadas para aplicação no diagnóstico da infecção natural de roedores. A partir dos estudos experimentais, deverão ser conhecidos os fatores que controlam o curso da infecção nestes hospedeiros.
Caracterização fenotípica e genotípica de cepas de Aeromonas isoladas de diversas fontes
Prof. Angela Corrêa de Freitas AlmeidaA importância do Gênero Aeromonas ,pertencente à família Aeromonadaceae vem aumentando nas últimas décadas devido a trabalhos que evidenciam sua participação em inúmeros processos patológicos em seres humanos e animais, o que é agravado quando se considera sua ampla distribuição ambiental. O tipo mais frequente de infecção é a intestinal e ocorre quando o indivíduo ingere água ou alimentos contaminados, mas também são encontradas infecções extraintestinais como de feridas, septicemia, meningite, pneumonia e doença hepatobiliar .Este projeto tem por finalidade detectar determinantes ( fatores ) que estão envolvidos na virulência ( potencial patogênico ) de cepas de Aeromonas isoladas de alimento, material clínico e meio ambiente. Essa caracterização vem sendo realizada utilizando métodos fisiológicos laboratoriais convencionais através da detecção da capacidade de produção de toxinas, exoenzimas, capacidade de aderir e invadir linhagens celulares em cultivo in vitro . Recentemente, métodos moleculares para a determinação de cepas patogênicas vem sendo utilizada com muito sucesso, especificidade e sensibilidade. Esses métodos objetivam caracterizar e identificar genes marcadores de virulência. São utilizadas técnicas moleculares como o PCR e a hibridação para detecção de gens de virulência envolvidos na produção de toxinas e hemolisinas. . Com o resultado deste estudo esperamos contribuir para o entendimento da inter-relação entre cepas recuperadas dos alimentos e cepas isoladas de espécimes clínicos, demonstrando que os alimentos podem veicular cepas com marcadores importantes de virulência ressaltando seu significado na área da saúde pública , tornando possível o desenvolvimento de procedimento de estratégias que garantam a segurança alimentar e a saúde do consumidor.
Diagnóstico, prevalência e caracterização do potencial patogênico de Escherichia coli produtoras de toxina Shiga (STEC)
Prof. João Ramos Costa AndradeAs Escherichia coli produtoras de toxina Shiga (STEC) são consideradas típicos patógenos emergentes. Mais de 200 sorotipos de STEC foram relatados mas certos sorotipos associam-se à doença humana, especialmente O157:H7; O26:H11 e O111:H-, sendo denominados E. coli enterohemorrágicas (EHEC). Um amplo espectro de doenças humanas tem sido relacionado a estes patógenos, de diarréias brandas a complicações graves como colite hemorrágica, síndrome uremica hemolítica e púrpura trombótica trombocitopenica. A toxina Shiga (Stx) é o principal fator de virulência destes microrganismos e bovinos são o seu principal reservatório, sendo a maioria dos surtos epidêmicos decorrentes da transmissão do agente por carne bovina mal cozida e por leite não-pasteurizado. Surtos e casos esporádicos são reportados principalmente no hemisfério Norte mas também em países como África do Sul, Austrália, Chile e especialmente Argentina. Observa-se nítida associação entre ocorrência de doença humana e colonização do reservatório animal. No Brasil são poucos os relatos de doença humana por STEC, contrastando com a vizinha Argentina, que apresenta a mais alta prevalência mundial da doença. Por outro lado, em nosso país STEC tem sido isolada de alimentos e do reservatório bovino. Temos utilizado metodologia de diagnóstico molecular (PCR e sondas genéticas) para identificar a presença de STEC/EHEC. Estudo inicial do nosso grupo permitiu isolar, pela primeira vez no país, amostras de STEC do sorotipo O157:H7, no Estado do RJ. Em novo estudo, investigamos 2000 animais de 5 regiões geopolíticas do Estado do Rio de Janeiro, com elevada positividade (48%) para STEC e isolamento de STEC O157:H7. No Rio Grande do Sul, obtivemos 61% de animais positivos para STEC, encontrando-se em andamento o isolamento destes patógenos. As amostras já isoladas nestes estudos vem sendo investigadas quanto a sua epidemiologia molecular e estrutura clonal por RAPD-PCR e PFGE, genes de virulência e propriedades de virulência como expressão de toxinas, atividade hemolítica e aderência e invasão à células. Recentemente, descrevemos uma nova propriedade de virulência para estes microrganismos, a capacidade de invadir enterócitos humanos in vitro.
Estrutura genética de isolados clínicos de Escherichia coli enteroagregativa (EAEC): filogenia, diversidade e virulência
Prof. João Ramos Costa Andrade e Prof. Maria das Graças de Luna GomesEstudos epidemiológicos recentes sugerem que cepas de Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) emergiram como um potencial patógeno entérico causador de diarréia em crianças. Vários estudos revelaram uma significativa associação entre EAEC e a diarréia persistente, embora uma associação entre EAEC e casos de diarréia aguda também tenha sido descrita. A estrutura genética de populações de E. coli patogênica tem sido amplamente estudada, mas pouco se sabe sobre a filogenia de patógenos emergentes como EAEC. Portanto, o estudo filogenético de EAEC merece maiores investigações para melhor compreensão das bases genéticas desse enteropatógeno emergente. Em nosso estudo utilizamos um conjunto de cepas EAEC isoladas por Rosa e colaboradores (J. Med. Microbiol., 47: 781-790;1998). As cepas EAEC foram isoladas de fezes de crianças de área urbana, com menos de dois anos de idade, internadas no Hospital Universitário Pedro Ernesto (HUPE) com sintomas de diarréia aguda e de crianças saudáveis não-hospitalizadas que não apresentavam sintomas. A aplicação conjunta das técnicas de PCR-triplex e RAPD-PCR para identificação dos grupos filogenéticos permite o agrupamento filogenético das cepas EAEC analisadas e a diferenciação de linhagens pertencentes a um mesmo grupo filogenético. Os objetivos específicos são: i) Determinar a posição filogenética das cepas EAEC dentro da coleção ECOR, ii) Investigar a relação entre grupos filogenéticos e os sorotipos EAEC, iii) Estabelecer uma associação entre grupos filogenéticos, a presença de genes de virulência e o potencial patogênico das cepas EAEC
Estudo da Lipodistrofia em Aids
Prof. Dirce Bonfim de LimaOs profissionais que lidam com HIV/Aids desde o início da década de 80, trabalharam numa época sem disponibilidade de anti-retrovirais ( ARV ). Atualmente existe um número razoável destes medicamentos, que trazem benefícios e também reações colaterais para os pacientes. Objetivos: Avaliar se os doentes em uso de ARV têm maior incidência de desenvolvimento de lipodistrofia. Material e métodos: Pacientes de ambos os sexos soropositivos para HIV e virgens de tratamento ARV foram convidados a participar de pesquisa que constou de avaliação de dados antropométricos, exames laboratoriais ( hemograma, bioquímica, dosagens hormonais, CD4 e carga viral ). No interrogatório dirigido foi valorizado o relato espontâneo de mudança da imagem corporal. Seguimos as normas do Ministério da Saúde para o uso de ARV. Resultados obtidos: Cinquenta e oito pacientes foram acompanhados de setembro de 1999 a setembro de 2001. Os pacientes que iniciaram esquema ARV apresentaram níveis séricos expressivamente menores de HDL-colesterol e de cortisol basal e níveis maiores de glicemia de jejum pós-prandial, quando comparados aos que não usavam nenhum medicamento ARV. Apesar destes resultados, nenhum caso individual de lipodistrofia foi diagnosticado, visto que não houve relato espontâneo de mudança da imagem corporal, considerado dado de maior valor diagnóstico. O grupo de pacientes continua em acompanhamento. Conclusões: O tempo de observação dos pacientes no estudo foi inferior ao relatado na literatura para a ocorrência de lipodistrofia. Nossa proposta inicial é que as alterações laboratoriais apresentadas possam ser indicadoras preliminares do surgimento da síndrome.
Estudos de aderência e etiopatogenia em microrganismos corineformes de importância médica: caracterização biologia, imunoquímica e molecular de fatores microbianos e celulares
Prof. Arnaldo Feitosa Braga de AndradeAs infecções causadas pelo C. diphtheriae ainda são observadas em diferentes continentes, incluindo os países onde ocorreu melhoria das condições sócio-econômicas e a vacinação tem sido realizada de maneira satisfatória. Os estudos moleculares demonstraram diversidade genética, geralmente correlacionada com dados epidemiológicos, entre amostras de C. diphtheriae. A susceptibilidade do C. diphtheriae à modificações genéticas parece favorecer o aparecimento de epidemias em larga escala. Os surtos epidêmicos descritos em alguns países, inclusive no Brasil, assim como os quadros de infecções invasivas foram relacionados com clones específicos de bacilo diftérico. Pouco se sabe sobre os mecanismos de patogenicidade de amostras atoxinogênicas de C. diphtheriae e de outras bactérias corineformes , embora elas sejam capazes de causar infecções diversas incluindo as invasivas frequentemente fatais. Os constantes surtos epidêmicos de difteria, a participação do C. diphtheriea e de outras espécies de corinebactérias em processos infecciosos humanos e o aumento dos níveis de resistência aos antimicrobianos justificam a realização de investigações epidemiológicas, de estudos sobre a virulência bacteriana e de pesquisas laboratoriais acessíveis e seguras para detecção desses microrganismos. O atual risco de uma pandemia de difteria, associado ao aumento das viagens internacionais e a emergência de clones epidêmicos e invasores, reforçam a importância do contínuo monitoramento da dispersão de clones e a distinção entre os casos importados, endêmicos e epidêmicos, permitindo a implementação de medidas preventivas, adequadas e rápidas, de controle da difteria pelos órgãos de Saúde Pública do País. O projeto visa investigar aspectos fenotípicos e genotípicos de amostras de C. diphtheriae e de outras bactérias corineformes isoladas de processos infecciosos diversos, ocorridos em diferentes regiões do Brasil. Para tanto, os seguintes estudos são propostos: Análise fenotípica pelos métodos bioquímicos convencionais e pelo Sistema API-Coryne. Análise do perfil de susceptibilidade aos agentes antimicrobianos pelos métodos de difusão em ágar e E-Test; Avaliação da aderência dos microrganismos às células hospedeiras, e identificão de componentes bacterianos e receptores celulares envolvidos no processo de aderência. Análise do perfil de proteínas totais e de polimorfismo genético gerado a partir de amplificação randômica de segmentos de DNA (Random Amplified Polymorphic DNA Typing, RAPD-PCR). Pesquisa da presença de gen tox pela técnica de PCR, da produção de toxina diftérica através de métodos imunológicos e análise do seu efeito citopático em culturas de células VERO. Análise da heterogeneidade dos gene dtxR e do gene tox pela técnica de Polimorfismo Conformacional de Fita Simples (Single-Strand Conformation Polymorphism PCR - SSCP) utilizando iniciadores diversos, e obtenção de sonda genética para a detecção de gene tox e de gene dtxR espécie-específico. Este tema configura-se relevante no esclarecimento dos mecanismos de aderência do C. diphlheriae, visando, futuramente, contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias de prevenção e tratamento da infecção inclusive pelo microrganismo atoxinogênico (terapia anti-adesina). Além de estender o modelo de estudo de aderência para as diversas espécies do gênero e outros corineformes de importância médica. Os resultados obtidos serão publicados em periódicos internacionais indexados e comporão dissertações e teses de alunos da Graduação e da Pós-Graduação. Os participantes do projeto possuem ampla experiência no estudo da difteria e outras infecções causadas por corinebactérias, constituindo o "Centro de Referência Nacional para Difteria e outras Corinebacterioses" (Fundação Nacional de Saúde, Ministério da Saúde) . No Brasil, verificaram que amostras de C. diphtheriae do biotipo fermentador da sacarose (sac +) predominam no trato respiratório enquanto o biotipo (sac-) é isolado predominantemente da pele. Demonstraram que os biotipos (sac+) e (sac-) interagem diferentemente com lectinas, descreveram a presença de ácido N-acetilneuramínico na superfície do microrganismo (Mattos-Guaraldi et al., 1999) e sua incorporação por reação de trans-sialidase (Mattos-Guaraldi et al., 1998). Os glicoconjugados funcionam como hidrofilinas na superfície microbiana (Mattos-Guaraldi et al., 1999). Estudos recentes demonstraram que a aderência de C. diphtheriae a células HEp-2 correlaciona-se com a atividade hemaglutinante e com proteínas da superfície bacteriana (Colombo et al., 2001).
Fatores determinantes do caráter oportunista de Pseudomonas aeruginosa.
Prof. Maria Cristina Maciel PlotkowskiP. aeruginosa são bactérias oportunistas. Em pacientes com comprometimento de seus mecanismos de defesa causam, com freqüência, infecções disseminadas. A interação dos microrganismos com células de revestimento de vasos sanguíneos é uma etapa indispensável tanto para sua disseminação hematogênea quanto para o aparecimento de microabscessos metastáticos em diversos órgão, achado freqüente no curso de processos septicêmicos por P. aeruginosa. A invasividade bacteriana é também favorecida pela capacidade de P. aeruginosa de aderir e degradar componentes da matriz extracelular (MEC). Justifica-se, portanto, o estudo da interação desses microrganismos com células endoteliais humanas e com componentes da MEC. P. aeruginosa são também agentes de infecções respiratórias em pacientes com fibrose cística (FC), levando à deterioração progressiva de sua função pulmonar. A identificação de mecanismos favorecedores da aderência bacteriana às células hospedeiras, da invasão microbiana e morte das células infectadas possibilitará a adoção de medidas profiláticas/terapêuticas que aumentem a sobrevida dos pacientes com FC.
Fatores do hospedeiro e do microrganismo associados à gênese da diarréia aguda e persistente por Escherichia coli enteropatogênicas
Prof. João Ramos Costa AndradeAs infecções intestinais ainda constituem importante causa de morte em nosso país, particularmente entre crianças. Entre as diarréias de etiologia bacteriana, aquelas causadas por Escherichia coli diarreiogênicas destacam-se pela sua freqüência. Neste projeto, investigamos propriedades de virulência de estirpes de E.coli causadoras de diarréia aguda e persistente em crianças, especialmente adesinas e invasinas bacterianas associadas à colonização do intestino humano e a internalização microbiana nos enterócitos. Adicionalmente, investigamos as bases moleculares da invasão bacteriana, os mecanismos celulares e microbianos envolvidos na multiplicação e persistência bacteriana no interior dos enterócitos e a resposta celular decorrente da interação com o microrganismo. Para estes estudos, utilizamos modelos experimentais como cultura de células e biópsias intestinais, empregamos drogas que interferem seletivamente com o citoesqueleto e com vias de transdução de sinais dos enterócitos e investigamos estruturas e funções microbianas através de microscopia convencional e de fluorescência e de observações ultraestruturais empregando microscopia eletrônica de transmissão e de varredura. Até o momento, obtivemos evidências de que certas estirpes de E. coli diarreiogênicas são capazes de persistirem no interior de enterócitos humanos por tempo prolongado, sem aparentemente causarem lesão significativa ou estimulação à produção local de citocinas pro-inflamatórias. Tal situação poderia justificar a existência de portadores assintomáticos destes microrganismos, que não apresentam reservatório animal. Por outro lado, verificamos importantes diferenças na capacidade de associação e internalização de algumas destas estirpes de E. coli relacionadas à acessibilidade dos pólos apical e basolateral dos enterócitos, indicando que o processo de aderência e invasão sofre modulação decorrente do grau de polarização e diferenciação do epitélio intestinal, com receptores distintos participando das etapas de aderência e de internalização
Marcadores de resistência a antimicrobianos associados a plasmídios em espécies de Aeromonas isoladas de alimentos e espécimes clinicos.
Prof. Angela Corrêa de Freitas AlmeidaO interesse pelo gênero Aeromonas foi renovado e intensificado nos últimos 20 anos devido a sua emergência na participação em clínica médica, gerando um grande número de estudos sobre a sua complexa taxonomia a fim de se identificar novas espécies e definir grupos patogênicos para o ser humano, assim como estabelecer os fatores de virulência destes microrganismos potencialmente envolvidos no desenvolvimento das síndromes clínicas . Diversas propriedades fenotípicas bacterianas, como resistência a antimicrobianos ou fatores de virulência, têm sido relacionadas a plasmídios em Aeromonas spp. A presença de plasmídios nestes microrganismos potencialmente patogênicos representa um risco, pois as características de resistência podem ser transferidas a outros patógenos, ou ainda podem dificultar o sucesso da antibioticoterapia em infecções provocadas por cepas de Aeromonas spp. carreadoras destes elementos genéticos . Considerando a carência de dados a respeito da presença de marcadores de resistência a antimicrobianos associados a plasmídios em espécies de Aeromonas spp. circulantes na nossa região, nosso trabalho teve como objetivos, investigar o perfil de susceptibilidade a diversos antimicrobianos, utilizando o teste de difusão a partir de discos, determinar as Concentrações Mínimas Inibitórias (CMI) para as cepas de origem clínica e de alimentos que apresentaram resistência a pelo menos um dos antimicrobianos (excetuando-se os -lactâmicos), verificar a presença de plasmídios em cepas caracterizadas como resistentes e relacionar o marcador de resistência aos plasmídios através de cura e transferência do marcador por transformação.Com os nossos resultados esperamos contribiur com a detecção de cepas que apresentam potencial de resistência a diversos antimicrobianos, com presença de plasmídios associados aos respectivos fenótipos de resistência .Nossos achados representam a importância do isolamento de cepas de Aeromonas com resistência múltipla, associado a plasmídios, veiculados por alimentos.
Patologia da infecção por Rhodococcus equi em pacientes com SIDA
Prof. Daurita Darci de PaivaO pulmão é sede freqüente de infecção oportunistas em pacientes portadores de infecção pelo vírus da imunodeficiência humana, Rhodococcus equi bactéria aeróbia, Gram positiva, intracelular facultativa, que se multiplica em fagosomas de macrófagos, é bem conhecida na medicina veterinária. Inúmeros casos de infecção por R. equi foram relatados em pacientes com SIDA, neoplasias malignas ou submetidos a terapia imunosupressora. O gênero Rhodococcus está amplamente distribuídas na natureza, principalmente no solo e em fezes de herbívoros. A primeira infecção humana foi relatada por GOLUB et al. (1967), a partir de então, vários casos foram descritos, a maioria, em pessoas com algum tipo de imunodeficiência. Com o advento da SIDA, a infecção por R. equi tornou-se mais um problema a ser enfrentado na clínica. A patogenia da infecção por R. equi, no homem, não está clara, mas a transmissão pode ocorrer através do solo ou de animais contaminados e por inalação. Estudos experimentais sugerem a bactéria é capaz de inibir funções bactericidas oxidativas dos polimorfonucleares. O organismo sobrevive dentro do fagosoma e inibe a fusão do fagolisosoma. Em associação com a infecção por R. equi, foram relatados vários casos de malacoplaquia, doença granulomatosa, pseudotumoral, rara, caracterizada histologicamente pela presença de macrófagos/monócitos e pelo achado de formações calcificadas intra e extracelulares, denominadas corpúsculos de Michaelis-Gutmann. Descrita inicialmente por Michaelis e Gutmann em 1902 e von Hanseman, a patogenia da malacoplaquia não está completamente esclarecida. Acredita-se que seja resultante de alteração dos macrófagos, provavelmente a nível dos fagolisosomas, resultando numa digestão deficiente das bactérias. O primeiro caso de malacoplaquia em paciente VIH+ e com SIDA foi relatado por SCANNELL et al. (1990). A partir de então, outros casos foram descritos na literatura, todos eles em associação com infecção por R. eqüi e localizados no aparelho respiratório. Objetivos: Estudar as alterações morfológicas da malacoplaquia e a infecção pulmonar por R. equi, através de microscopias óptica e eletrônica de transmissão. Metodologia: material de biópsias fixado em formol tamponado à 10%, embebido em parafina, seccionado em 3-5 (m, corado por Hematoxilina e Eosina (H(E), PAS, Gram Brown-Brenn, Fite e prata metenamina de Grocott. Para microscopia eletrônica, o material fixado em parafina foi/será desparafinado em xilol, pós-fixado em glutaraldeído a 2,5%, seguindo a rotina para microscopia eletrônica. Resultados parciais: as alterações produzidas por R. equi e os aspectos morfológicos da malacoplaquia, com lesões em brônquio e parênquima pulmonar, em pacientes HIV+, transplantados, com doenças crônicas e neoplasias malignas foram observadas por vários autores. Em pacientes com SIDA, todos os casos relatados na literatura mundial foram associados com R. equi e, em geral, localizados no aparelho respiratório. Os aspectos por nós observados às microscopias eletrônica de transmissão, reforçam as hipóteses sobre a formação de corpúsculos de Michaelis-Gutmann. No entanto, desconhecem-se, até o momento, quais os mecanismos que favorecem o desenvolvimento de malacoplaquia pulmonare por R. equi, principalmente em pacientes VIH+. Diferentemente da malacoplaquia em testículos, próstata e no trato urinário, que está comumente associada com infecção por E. coli.
Patologia da microsporidiose
Prof. Daurita Darci de PaivaMicrosporídios são protozoários intracelulares obrigatórios, classificados no filo Microspora. Espécies do gênero Encephalitozoon tais como E. cuniculi, E. hellem e E. intestinalis (Septata) estão relacionadas com a patogenia de peritonite, hepatite, infecção ocular, infecção nasal e doença disseminada em pacientes infectados pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV+). O diagnóstico de microsporídios pode ser feito em microscopia óptica, através de colorações pela Hematoxilina e Eosina (H(E), Giemsa e Gram (Brown-Brenn, Brown-Hopps). Os parasitas são encontrados no centro da lesão em células epiteliais, endoteliais ou macrófagos. Anticorpos anti-encefalitozoon podem ser detectados em pessoas aparentemente sadias, sugerindo que infecções subclínicas são comuns e que poderiam ser reativadas em pacientes imunocomprometidos. Enterocytozoon bieneusi, Encephalitozoon hellem, E. intestinalis e E. cuniculi são as espécies mais freqüentes em pacientes infectados pelo HIV e em paciente portadores de transplantes de órgãos .
Objetivos: estudar a patogenia e identificar as diferentes esp/ecies de microsporios em pacientes portadores da síndrome de imunodeficiência adquirida (SIDA) e em pacientes transplantados.
Metodologia: material de biópsias fixado em formol tamponado à 10%, embebido em parafina, seccionado em 3-5 (m, corado por Hematoxilina e Eosina (H(E), Giemsa, Gram Brown-Brenn, Fite e prata metenamina de Grocott. Para microscopia eletrônica, o material fixado em parafina foi/será desparafinado em xilol, pós-fixado em glutaraldeído a 2,5%, seguindo a rotina para microscopia eletrônica.
Resultados parciais: de trinta e nove biópsias (39) examinadas, nove (23%) apresentaram alterações relacionadas à presença de esporos de microsporídios. As vilosidades, duodenais ou ileais, apresentaram atrofia de leve a grave, edema e aumento de plasmócitos, macrófagos e linfócitos na lâmina própria. Os esporos foram identificados no citoplasma de enterócitos, na face luminal da célula, na porção basal e, raramente, na lãmina própria Em cortes de tecidos corados por H(E, Giemsa e Brown-Brenn.
Na microscopia eletrônica de transmissão observamos formas jovens, de limites pouco definidos, com presença de vários núcleos, exibindo precursores do filamento polar (plasmódio multinucleado); esporos revestidos por membrana constituída por três camadas; células descamadas ou em processo de extrusão, repletas de esporos maduros, foram vistas com freqüência. A patogenia da mcrosporidiose ainda permanece pouco conhecida
Microsporídios são protozoários intracelulares obrigatórios, classificados no filo Microspora. Espécies do gênero Encephalitozoon tais como E. cuniculi, E. hellem e E. intestinalis (Septata) estão relacionadas com a patogenia de peritonite, hepatite, infecção ocular, infecção nasal e doença disseminada em pacientes infectados pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV+). O diagnóstico de microsporídios pode ser feito em microscopia óptica, através de colorações pela Hematoxilina e Eosina (H(E), Giemsa e Gram (Brown-Brenn, Brown-Hopps). Os parasitas são encontrados no centro da lesão em células epiteliais, endoteliais ou macrófagos. Anticorpos anti-encefalitozoon podem ser detectados em pessoas aparentemente sadias, sugerindo que infecções subclínicas são comuns e que poderiam ser reativadas em pacientes imunocomprometidos. Enterocytozoon bieneusi, Encephalitozoon hellem, E. intestinalis e E. cuniculi são as espécies mais freqüentes em pacientes infectados pelo HIV e em paciente portadores de transplantes de órgãos .
Objetivos: estudar a patogenia e identificar as diferentes esp/ecies de microsporios em pacientes portadores da síndrome de imunodeficiência adquirida (SIDA) e em pacientes transplantados.
Metodologia: material de biópsias fixado em formol tamponado à 10%, embebido em parafina, seccionado em 3-5 (m, corado por Hematoxilina e Eosina (H(E), Giemsa, Gram Brown-Brenn, Fite e prata metenamina de Grocott. Para microscopia eletrônica, o material fixado em parafina foi/será desparafinado em xilol, pós-fixado em glutaraldeído a 2,5%, seguindo a rotina para microscopia eletrônica.
Resultados parciais: de trinta e nove biópsias (39) examinadas, nove (23%) apresentaram alterações relacionadas à presença de esporos de microsporídios. As vilosidades, duodenais ou ileais, apresentaram atrofia de leve a grave, edema e aumento de plasmócitos, macrófagos e linfócitos na lâmina própria. Os esporos foram identificados no citoplasma de enterócitos, na face luminal da célula, na porção basal e, raramente, na lãmina própria Em cortes de tecidos corados por H(E, Giemsa e Brown-Brenn.
Na microscopia eletrônica de transmissão observamos formas jovens, de limites pouco definidos, com presença de vários núcleos, exibindo precursores do filamento polar (plasmódio multinucleado); esporos revestidos por membrana constituída por três camadas; células descamadas ou em processo de extrusão, repletas de esporos maduros, foram vistas com freqüência. A patogenia da mcrosporidiose ainda permanece pouco conhecida
Microsporídios são protozoários intracelulares obrigatórios, classificados no filo Microspora. Espécies do gênero Encephalitozoon tais como E. cuniculi, E. hellem e E. intestinalis (Septata) estão relacionadas com a patogenia de peritonite, hepatite, infecção ocular, infecção nasal e doença disseminada em pacientes infectados pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV+). O diagnóstico de microsporídios pode ser feito em microscopia óptica, através de colorações pela Hematoxilina e Eosina (H(E), Giemsa e Gram (Brown-Brenn, Brown-Hopps). Os parasitas são encontrados no centro da lesão em células epiteliais, endoteliais ou macrófagos. Anticorpos anti-encefalitozoon podem ser detectados em pessoas aparentemente sadias, sugerindo que infecções subclínicas são comuns e que poderiam ser reativadas em pacientes imunocomprometidos. Enterocytozoon bieneusi, Encephalitozoon hellem, E. intestinalis e E. cuniculi são as espécies mais freqüentes em pacientes infectados pelo HIV e em paciente portadores de transplantes de órgãos .
Objetivos: estudar a patogenia e identificar as diferentes esp/ecies de microsporios em pacientes portadores da síndrome de imunodeficiência adquirida (SIDA) e em pacientes transplantados.
Metodologia: material de biópsias fixado em formol tamponado à 10%, embebido em parafina, seccionado em 3-5 (m, corado por Hematoxilina e Eosina (H(E), Giemsa, Gram Brown-Brenn, Fite e prata metenamina de Grocott. Para microscopia eletrônica, o material fixado em parafina foi/será desparafinado em xilol, pós-fixado em glutaraldeído a 2,5%, seguindo a rotina para microscopia eletrônica.
Resultados parciais: de trinta e nove biópsias (39) examinadas, nove (23%) apresentaram alterações relacionadas à presença de esporos de microsporídios. As vilosidades, duodenais ou ileais, apresentaram atrofia de leve a grave, edema e aumento de plasmócitos, macrófagos e linfócitos na lâmina própria. Os esporos foram identificados no citoplasma de enterócitos, na face luminal da célula, na porção basal e, raramente, na lãmina própria Em cortes de tecidos corados por H(E, Giemsa e Brown-Brenn.
Na microscopia eletrônica de transmissão observamos formas jovens, de limites pouco definidos, com presença de vários núcleos, exibindo precursores do filamento polar (plasmódio multinucleado); esporos revestidos por membrana constituída por três camadas; células descamadas ou em processo de extrusão, repletas de esporos maduros, foram vistas com freqüência. A patogenia da mcrosporidiose ainda permanece pouco conhecida
Prevenção da transmissão vertical do HIV
Prof. Haroldo José de Matos e Prof. Ronaldo Curi GismondiA via de transmissão de mãe para filho é um dos aspectos mais dramáticos vividos pela mulher infectada pelo HIV. E é particularmente importante devido à característica de feminização que a epidemia tem assumido em nosso país.
A taxa de transmissão do vírus da mãe infectada para o filho está em torno de 25%, chegando até 40% na África, sem qualquer tipo de intervenção, segundo estimativas da literatura (Mandelbrot, 1998). Após a introdução da profilaxia com AZT, essa taxa foi reduzida para 7,6%. E dados mais recentes, sobre intervenções que incluem outras drogas além do AZT, conseguiram reduzir ainda mais essa taxa para valores em torno de 2% (Moffenson, 1999). No Brasil, há poucos estudos, e a taxa de transmissão do vírus sem intervenção ficava em torno de 16 a 39 % (Rubini, 1996; Tess, 1998). Em estudo realizado no Rio de Janeiro em 1998, com profilaxia anti-retroviral com ZDV, a taxa de transmissão ficou em 7,9%, e um estudo mais recente, apresentado em Durban, na África do Sul, a taxa ficou em 6,0 %. (Nogueira, 2001). Alguns relatos trazem evidências edicionais de que a associação de drogas anti-retrovirais em um esquema terapêutico altamente agressivo, incluindo além da ZDV, o 3TC, e Inibidores de Protease (HAAR-highly active anti-retorviral therapy) pode reduzir a transmissão vertical a um evento raro. Um dos objetivos mais importantes dessa terapia agressiva é a redução da carga viral nas mães (para taxas abaixo de 1000 cópias por ml). O que alguns pesquisadores têm ponderado, no entanto, é que se por um lado essa associação de drogas previne de modo significativo a transmissão vertical, por outro lado existe uma probabilidade maior de que surja resistência do vírus a uma ou mais drogas componentes da associação. Essa observação é importante porque pode comprometer a qualidade do tratamento da mãe após o parto. Portanto, é importante definir que associações são efetivamente mais importantes na redução da transmiossão vertical, bem como é necessária uma melhor definição do tempo de uso desses medicamentos durante a gestação.
Apesar da redução significativa obtida pela quimioprofilaxia/quimioterapia na transmissão vertical, permanece ainda uma probabilidade de infecção. Essa probabilidade residual poderia estar associada a fatores associados à transmissão intra-uterina, que seria menos sensível à profiliaxia com antiretrovirais.
O objetivo básico deste projeto é discriminar fatores de risco adicionais especificamente ligados à transmissão intrauterina. Essa discriminação é importante, pois ela pode tornar mais clara a estratégia de intervenção medicamentosa mais efetiva para a prevenção da transmissão vertical do HIV, de modo a não prejudicar também o tratamento materno a longo prazo. Para isso, a estratégia para identificação da infecção intra-uterina da criança a ser adotada será baseada no método do PCR que amplia RNA, para a detecção de vírions livres, durante as primeiras 48 horas após o parto. Esse teste será repetido após 14 dias, e aos 6 meses de idade. Após os 18 meses será realizado o teste de ELISA para a detecção de imunoglobina G anti-HIV.
Regulação da resposta imune celular a agentes infecciosos
Prof. Geraldo Pereira e Prof. Maria Cristina V. PessolaniO contato do sistema imune com estímulo antigênico persistente induz um espectro de padrões de resposta, com participação predominante de imunidade humoral ou celular, ou mesmo situações em que ocorrem estados que poderiamos chamar de "não-resposta imunológica". Os mecanismos envolvidos na diferenciação da resposta imune celular a estímulo persistente tem uma relevância fundamental para o esclarecimento da biologia do sistema imune, e grande importância prática, pois a interação do sistema imune humano com estímulos persistentes está associada a doenças alérgicas(antígenos ambientais), infecções ( hanseníase, paracoccidioidomicose, tuberculose, leishmaniose, ...), e sobrevivência de órgãos transplantados. Este projeto investiga, em pacientes com infecções crônicas e seus contatos saudáveis, os seguintes aspectos básicos: 1- Perfis de produção de citocinas em resposta ao agente infeccioso, e sua associação com resistência e susceptibilidade à infecção. 2- O papel de componentes micobacterianos, principalmente glicolipídios, como agentes moduladores de ativação de linfócitos T e fagócitos mononucleares. Os padrões de resposta imune humana são investigados neste projeto , através de métodos para identificação de subpopulações leucocitárias envolvidas e sensíveis às ações biológicas de componentes purificados de agentes infecciosos (culturas de leucócitos sanguíneos, quantificação de mediadores e citometria de fluxo). Observações mais recentes neste projeto evidenciaram associação de perfil "T helper O" de produção de citocinas com proteção contra infecção, enquanto respostas "T helper 1" ou anergia, foram associadas a lesão inflamatória e doença em hanseníase. Outros experimentos mostraram que o glicolipídio fenólico-I ( PGL-I), um componente do envelope micobacteriano, presente no M. leprae e semelhante a outros glicolipídios micobacterianos, inibe seletivamente a expressão de CD28, bem como eventos precoces de ativação em linfócitos T (Modulação negativa do complexo CD3, indução de CD 69, CD25 e produção de interleucina-2).
Um modelo experimental para o estudo da interação entre a esquistossomose mansônica e distúrbios nutricionais ou hormonais do hospedeiro murino
Prof. José Roberto Machado e SilvaAs condições fisiológicas do hospedeiro desempenham papel fundamental na interação do S. mansoni. Temos verificado que os vermes, de ambos os sexos, são afetados por algumas modificações metabólicas do hospedeiro como a diabetes mellitus e a subnutrição. Animais desnutridos não apresentam a fibrose de Symmers, o tegumento e o aparelho reprodutor dos vermes são alterados. Nos camundongos diabéticos, o número de ovos eliminados nas fezes e a sua maturidade são reduzidas na parede intestinal. Entretanto, não é conhecido se existe uma relação entre estas alterações e alterações funcionais na biologia do parasito ou na evolução da infecção. Além disso, não está plenamente esclarecido como as mudanças hormonais podem afetar a relação entre o helminto e o hospedeiro. A conclusão deste projeto poderá contribuir para a compreensão dos mecanismos fisiopatológicos destas doenças, a partir da extrapolação do estudo em animais, que devido à sua complexidade e as questões éticas, não podem ser obtidos a partir de estudo em seres humanos. Objetivos: Avaliar a influência de alterações metabólicas (subnutrição, diabetes mellitus e colesterolemia) do hospedeiro sobre o quadro parasitológico, as características fenotípicas dos vermes adultos e na formação do granuloma esquistossomótico hepático; Dosar os hormônios da tireóide, do timo, os sexuais e o colesterol nos animais experimentalmente infectados, em diferentes semanas de infecção. Metodologia: Nos vermes adultos isolados de camundongos realizar estudo morfológico por microscopia de luz, microscopia de varredura laser confocal e microscopia eletrônica de varredura. O acompanhamento da infecção é realizado por exame de fezes, contagem de ovos nos tecidos e estudo histopatológico do fígado, baço, pâncreas e intestino.
Avaliação da resposta imune celular associada à cura e à proteção na leishmaniose tegumentar americana.
Prof. Alda Maria Da-CruzDurante a doença ativa, pacientes de leishmaniose tegumentar americana (LTA) apresentam uma indução preferencial de células T CD4+ reativa a antígenos de Leishmania e um perfil misto de produção de citocinas (IFN-g, IL-4, IL-5). A evolução para cura está associada a um aumento de linfócitos CD8+ e ausência de IL-4. Neste projeto pretende-se avaliar os mecanismos imunológicos associados ao desenvolvimento das lesões, bem estabelecer a função de celulas efetoras responsáveis pela imunidade duradoura que se estabelece anos após a cura clínica da doença. Serão estudados pacientes de leishmaniose cutânea, mucosa e disseminada antes e após o tratamento, bem como anualmente após o tratamento. Serão analisados a resposta proliferativa de linfócitos, a caracterização do fenótipo celular e funcional de linfócitos reativos a antígenos do parasito, quantificação de citocinas (IFN-g, TNF-a, IL-18, IL-4, IL-5, IL-10, TGF-b) no sobrenadantes de cultura de mononucleares e intracelulares, atividade citotóxica específica. Os perfis de resposta imune celular identificados serão correlacionados com a parâmetros clínico-evolutivos apresentados pelos pacientes.
Estudo do infiltrado inflamatório de lesões de leishmaniose tegumentar americana.
Prof. Alda Maria Da-CruzO infiltrado inflamatório de lesões de leishmaniose tegumentar americana (LTA) é predominantemente mononuclear, composto por linfócitos de "memória" não havendo diferenças entre células respondedoras para Leishmania, quanto para outros antígenos parasitários estão presentes nas lesões e produzem IFN-g. Isto sugere que linfócitos específicos para outros antígenos possam modular a evolução das lesões de leishmaniose. Serão estudados as lesões e o sangue periférico de pacientes com leishmaniose cutânea, mucosa e disseminada antes do tratamento. As células mononucleares das lesões dos pacientes serão avaliadas ex vivo quanto ao fenótipo celular, expressão de moléculas de adesão e de moléculas induzidas durante a ativação. Paralelamente, estas células serão estimuladas in vitro com antígenos de Leishmania e, como controle serão utilizados outros antígenos (Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi, PPD e toxóide tetânico). Os seguintes parâmetros serão estudados: resposta proliferativa de linfócitos, análise da freqüência de linfócitos respondedores a antígenos parasitários, quantificação de citocinas (sobrenadante, intracelular e frequência de células produtoras - ELISPOT), caracterização fenotípica qualitativa e funcional, análise das moléculas envolvidas na migração linfocitária entre o sangue e a lesão, citoxicidade específica. O perfil de resposta imune obtido será correlacionado aos parâmetros clínico-evolutivos das lesões.
Identificação e caracterização molecular de genes reparadores de DNA lesado por agentes oxidativos em Leishmania amazonensis.
Prof. Alexandre R. BelloDiferente de outros tripanossomatídeos, parasitos do gênero Leishmania multiplicam-se no interior dos fagolisossomos dos macrófagos. Portanto, estes parasitos devem ser capazes de sobreviver à produção de espécies ativas de oxigênio como peróxido de hidrogênio e óxido nítrico, entre outros potenciais agentes lesivos normalmente encontrados nestas organelas. Experimentos realizados pelo nosso grupo em promastigotas de Leishmania amazonensis, indicam claramente a existência de mecanismos eficientes de reparo das lesões introduzidas no DNA, tanto por espécies reativas de oxigênio quanto de nitrogênio, mecanismos extremamente importantes para a sobrevivência destes parasitos. O isolamento e a caracterização molecular de genes homólogos de reparo de lesões oxidativas em DNA se constituirão na base da elaboração de linhagens geneticamente modificadas de L. amazonensis que serão empregadas em estudos de sobrevivência celular in vitro e in vivo. Macrófagos em cultura podem ser estimulados a produzir artificialmente óxido nítrico pela incubação com interferon-gama e lipopolissacarídeos (LPS). Embora esta estimulação possa resultar na produção de NO, radicais superóxido ou ambos, somente o NO possui atividade leishmanicida. A correlação da expressão destas respostas celulares nas linhagens a serem desenvolvidas poderão representar achados novos e importantes para a compreensão do estabelecimento da infecção destes parasitos. OBJETIVO GERAL: Isolamento e a caracterização molecular de genes homólogos, capazes de repararem lesões oxidativas em DNA de L. amazonensis . Síntese da Metodologia: Efeitos da menadiona (MD) e peróxido de hidrogênio na sobrevivência celular de cepas de E. coli e L. amazonensis. Caracterização molecular de genes reparadores de lesões oxidativas. Confecção de mutantes de L. amazonensis apex-.
Complementação Funcional e Estudos in vitro e in vivo do gene apex (Lamap) de Leishmania amazonensis.
Prof. Alexandre R. BelloMembros constituintes da família das proteínas conhecidas como AP-Endo/Exonucleases (AP ou APEX) estão envolvidos no reparo de lesões introduzidas no DNA por agentes como as drogas antitumorais bleomicina e neocarzinostatina, ou aquelas que geram radicais de oxigênio e/ou nitrogênio Os principais relatos encontrados sobre genes da família das AP-endonucleases em tripanossomatídeos na literatura nos últimos cinco anos endereçam somente alguns aspectos bioquímicos da participação destes genes nos mecanismos de reparo de lesões oxidativas no DNA. A nível molecular estes descrevem estudos de complementação gênica não sendo esclarecedores ao nível de que forma a interferência na expressão destes poderá contribuir para a infectividade, virulência ou sobrevivência destes protozoários in vitro e in vivo. Nosso trabalho tem como objetivos o emprego da cepa BW535 mutante de E. coli (linhagem xth-, nfo-e nth-) para endereçar questões relativas a capacidade de reparo de lesões oxidativas do gene apex homólogo de L. amazonensis (Lamap). Pretendemos ainda, através de abordagem molecular, utilizando leishmânias transfectadas com plasmídios (pXG) expressando o gene Lamap produzindo RNAs no sentido correto da seqüência aberta de leitura, assim como no sentido reverso (RNAs antisentido), modular o nível de expressão destes genes através da seleção dos parasitos em meios de cultivo em concentrações crescentes dos antibióticos G418 (NEO) e/ou Higromicina B Fosfotransferase (HYG). Estes transfectantes serão empregados em ensaios in vitro com macrófagos de cultura e peritoniais, bem como in vivo com camundongos C57BLACK/6 e BALB/c.
Ocorrência, diagnóstico clínico-laboratorial, etiologia, tratamento e seqüelas de processos infecciosos que transcorrem nas mucosas naso-sinusais, faringo-laríngeas e do ouvido
Prof. Roberto MeirellesNeste projeto, investigamos vários aspectos dos processos infecciosos que ocorrem nas mucosas naso-sinusais e faringo-laríngeas ou levam a repercussões importantes na audição, especialmente em crianças. Assim, pesquisamos vírus e bactérias e avaliamos a microestrutura do tecido adenóideo e amigdaliano de crianças e adolescentes que foram submetidos a extirpação cirúrgica de adenóide e amígdalas. Em relação as sinusites infecciosas, as suas complicações são estudadas com o objetivo de identificarmos os agentes etiológicos e os fatores predisponentes e avaliarmos as manifestações clínicas e as formas de tratamento, bem como a evolução das seqüelas das complicações destas infecções. Quanto a Rinite Atrófica Secundária , estudamos o crescimento da incidência desta afecção causada por variados agentes etiológicos na população urbana e na rural, onde parece ser mais freqüente. Nestas investigações, temos particular interesse na avaliação dos meios de diagnóstico e no estudo da evolução dos casos. Finalmente, em relação as disacusias de etiologia infecciosa, estudamos as suas características clínicas e as formas de prevenção e tratamento. Estas afecções vem apresentando significativo aumento na incidência, tanto nas suas formas temporárias como nas definitivas, mais graves.